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用Double Digestion Designer精确完成复杂分子克隆

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   分子克隆虽然人人在做,但做好不易,因其中涉及到酶量计算,Buffer选择,反应体积,反应条件等多种条件摸索。

   Double Digestion Designer(DDD)是公司专门为此设计开发的一款在线软件。不仅能精确计算每次所需酶量,还能智能推荐最佳的反应Buffer, 查询同切酶,异切酶...进行复制酶切设计。

   案列,用户成功使用DDD完成了对EcoRI的部分酶切实验。

   背景:用户准备用EcoRI+XbaI在我的质粒上克隆外源基因,但酶切验证时发现在质粒上有两个EcoRI位点,所以不得不进行部分酶切。

   实验设计:先用XbaI进行完全酶切,然后加少量EcoRI,进行部分酶切,然后回收 只在一个 希望的EcoRI位点切开的条带进行克隆。

   复杂性:EcoRI 活性非常高,按照常规,即使只酶切5分钟,质粒上的两个EcoRI都全切开了,无法按照设计进行部分酶切。

   原因分析:EcoRI 活性虽然高,但在一个反应体系中起决定性的是酶的浓度,调整酶量和浓度是关键。

   成功实验步骤: 1. 对DNA进行定量。

                  2. 用DDD进行酶量计算。

                  3. 使用理论用量减少1/2,将酶切时间缩短到5分钟。

                  4. 加SDS终止反应

              5. 电泳 + 回收 + 克隆 + 测序验证

   结果: 用户未放弃EcoRI位点,运用先进的实验信息化工具,成功回收到预期的目的条带,在短短的3天内,完成了复杂的部分酶切实验,得到了理想的阳性克隆。