多角度分层次突变位点分析

随着组学数据分析热潮的到来，很多人开始关注外显子突变位点的问题；近来也有很多人来电咨询如何从序列分析，结构模拟等方面进行突变位点的分析。凑巧的是，最近刚刚与客户合作，完成了一个转录因子突变位点的项目，正好可以回答上面的问题。这个项目中转录因子突变位点的分析主要从序列分析，家族进化，修饰位点，结构模拟等多角度分层次进行研究。现在将整个过程总结如下：

一、序列分析

1.     确定突变位点位置和序列

   将实验中发现的转录因子两个突变位点与参考蛋白的序列进行比对，确定突变位点的位置，并找出突变前后的序列，进行分析。

2.     突变点功能预测

   通过BioMute数据库查找突变位点的信息，并通过Polyphen对突变点进行功能预测，预测结果显示其突变点皆为无公害点。

3.     结构域分析

   使用NCBI CDD数据库对转录因子进行结构域分析，结果显示转录因子属于zinc-finger家族，但突变点并未落在结构域。

二、家族进化

1.     绘制基因进化树

   在ENSEMBLE数据库中找到该转录因子并使用genetree工具绘制基因进化树，在整个数据库中，共找到来自280个不同物种的共316个同源家族基因。

2.     分析进化树

   对完整的进化树进行分析，从进化树中我们发现，转录因子与转录因子a两个亚家族最相似，不同于转录因子2，3，4等其他亚家族。数据分析，除了灵长类外，与人最相近的是小鼠的转录因子。

3.     保守性计算

   为了进一步分析转录因子中两个突变位点的功能，我们需要分析这两个位点的进化保守性，因为进化中保守的位点对蛋白的功能和结构都有显著的意义。我们从转录因子家族中提取转录因子亚家族的序列，通过muscle3.8软件做multiplealignment，然后分析位点的绝对保守性，并使用weblogo软件绘制seqlogo图。

   图中转录因子对应的是Position 11位置，而在物种中，该位置主要突变型为S，G与A，其中S与G重要性相当。

三、修饰位点分析

从突变类型看，转录因子都涉及了serine的突变，而serine通常是蛋白的磷酸化修饰位点。所以我们猜测，突变可能与蛋白磷酸化相关。使用NetPhos2.0和GPS3.0两个软件对突变后的序列进行磷酸化预测，结果表明，其中一个突变位点所处的片段很有可能是蛋白的磷酸化热点区域。

通过分析图中的结果，发现转录因子这两个突变位点更有可能是与磷酸化相关，通过调节蛋白磷酸化修饰而对蛋白本身及蛋白所行使的功能起作用。

四、蛋白结构模拟

为了进一步验证该假设，我们对蛋白进行结构模拟分析，该蛋白目前还没有已知的PDB结构，也没有同源的结构可以对蛋白进行同源建模，所以，结构模拟只能使用abinitio 算法。使用I-Tasser软件我们得到了下列结构模型。

使用chimera1.6中的rotamer算法(R.L.Dunbrack,Jr.2002)进行突变模拟，并与未突变模型进行结构比对获得结果。

通过分析突变结果发现，转录因子其中一个突变对周边结构没有重要影响，就是Serine多出的侧链增加了一定的表面，原本的某个蛋白位点上存在的与周边一个位点的氢键，在突变后也继续存在。转录因子的另外一个突变位点可能对磷酸化有影响，原蛋白位点处于一个磷酸化口袋的底部，并与周围一个位点形成氢键，用于加强结构的稳定性，这说明该点的重要性。在突变为G后，氢键消失，也不再具有与磷酸根的结合力。这点与之前的基于序列保守性的分析一致。由此，我们判断，转录因子的其中一个位点相对与另外一个位点对蛋白的危害性更大。

五、小结

文中对转录因子突变位点的分析从序列分析，家族进化，修饰位点，结构模拟等多角度分层次进行，并得到了相互的验证，是突变位点分析的一个成功范例。